普洱茶中的金花研究
作者簡(jiǎn)介
張理珉 云南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 副教授，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《地理標(biāo)志產(chǎn)品 普洱茶》主要起草人，圍繞著云南茶葉深加工，從事普洱茶微生物和發(fā)酵工藝技術(shù)研究。
程立忠 云南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 副教授，主要從事微生物學(xué)方面教學(xué)和科研 工作。
2010 年，一個(gè)偶然的機(jī)會(huì)，當(dāng)時(shí)由云南省質(zhì)量檢測(cè)院的張學(xué)忠副院長(zhǎng)介紹一位茶企的老總認(rèn)識(shí)，說(shuō)是在公司的一款 500 克普洱茶(熟茶)方磚中間有較多的金黃色顆粒，讓我們幫忙研究一下是什么微生物產(chǎn)生的?
通過(guò)顯微鏡觀察其上“ 金黃色的顆粒 ”為真菌中子囊菌的有性生殖過(guò)程形成的子實(shí)體 —— 子囊果中的閉囊殼，肉眼觀察呈金(亮)黃色粗大顆粒(有別于黃曲霉細(xì)粉狀暗黃色無(wú)性分生孢子)，俗稱“金花”，原有報(bào)
道廣泛存在于黑茶中，是湖南安化、陜西涇陽(yáng)茯(磚)茶等黑茶中的有益優(yōu)勢(shì)菌，在其發(fā)酵茶產(chǎn)品品質(zhì)中起著關(guān)鍵性作用。
既然在普洱茶緊壓茶中也有其蹤跡，從而說(shuō)明普洱茶生產(chǎn)加工過(guò)程中有適合“ 金花”菌生長(zhǎng)的條件，基于其是否會(huì)對(duì)普洱茶品質(zhì)的影響深入了解的目的，于當(dāng)年我們進(jìn)行茶葉市場(chǎng)走訪，尋找普洱茶中有金黃色的顆粒的相關(guān)茶樣，前后共收集了 30 多個(gè)樣品，發(fā)現(xiàn)在壓得較緊的生茶、熟茶里都存在其身影。后經(jīng)在實(shí)驗(yàn)室通過(guò)科學(xué)的分離純化研究發(fā)現(xiàn)，這些“金花”微生物還是分屬不同的種類(菌落形態(tài)、營(yíng)養(yǎng)需求等存在明顯不同)，但主要是散囊菌屬(Eurotium )中的一些菌種產(chǎn)生的。
茶葉中“金花”是什么?
茶葉中“ 金花 ”是一類真菌，和云南常見(jiàn)珍貴野生菌中的羊肚菌、塊菌等一樣，同屬真菌界子囊菌門(mén)(Ascomycota)，但其不能產(chǎn)生大型肉質(zhì)子實(shí)體。屬于子囊菌綱 (Ascomycetes)、散囊菌目(又稱曲霉目或不整囊菌目，Eurotiales)、曲霉科 (Eurotiaceae)、散囊菌屬(Eurotium)，為灰綠曲霉群的有性型屬 , 其主要特征為子囊果原基明顯 ,在營(yíng)養(yǎng)菌絲上形成螺旋狀產(chǎn)囊體 ; 子囊果為閉囊殼型 , 通常為黃色 , 球形或近球形 , 具有一層細(xì)胞厚的擬薄壁組織壁 , 內(nèi)生若干子囊孢子(子囊壁早期消解匯集一體); 子囊孢子呈雙凸鏡形 , 光滑或具不同紋飾。
無(wú)性型產(chǎn)生輻射狀或疏松柱狀的分生孢子頭 , 大多呈灰綠色 ; 產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)(小梗)單層 , 稍粗大 ; 分生孢子球形、卵形至洋梨形 , 大多帶綠色 , 較大 , 具小刺[1]。
本屬可承認(rèn)的分類群(種)約 20 個(gè)，我國(guó)已報(bào)道 11 個(gè)。
我國(guó)大量邊銷的茯磚茶，以其中“金花”(即茶磚上的“小黃點(diǎn)”)的多少作為鑒定品質(zhì)好壞的重要標(biāo)志，這些黃色小點(diǎn)實(shí)際上是散囊菌屬(Eurotium )某些菌種產(chǎn)生的黃色閉囊殼，被認(rèn)為是茯磚茶等黑茶發(fā)酵中的優(yōu)勢(shì)有益菌(徐國(guó)幀，1945;倉(cāng)道平和溫瓊英，1981;齊祖同和孫曾美，1990;劉作易等，1990)。
現(xiàn)今對(duì)茯磚茶存在的“金花”研究較為深入，主要優(yōu)勢(shì)菌種為冠突散囊菌(Eurotium cristatum )，因生長(zhǎng)繁殖時(shí)會(huì)產(chǎn)生金黃色的閉囊殼，俗稱“金花”，在高倍放大鏡下，“金花”呈金黃色，形狀如球形蘑菇。
目前根據(jù)我們的調(diào)查采樣分離，反映“金花”也普遍存在于普洱緊壓茶中，但人們對(duì)普洱茶中產(chǎn)“金花”的現(xiàn)象和“金花”微生物研究較少，對(duì)其系統(tǒng)化研究甚少，更談不上深入的了解、認(rèn)識(shí)和研究。通過(guò)我們的研究發(fā)現(xiàn)“金花”菌在普洱茶的出現(xiàn)，也是在特定條件形成的，在實(shí)際樣品中其對(duì)茶外觀和內(nèi)質(zhì)都有很大影響，對(duì)色、香、味等品質(zhì)形成上起到重要作用，使普洱生茶在短期內(nèi)可以形成老生茶的相關(guān)品質(zhì)，同時(shí)使其具備一定特殊菌香特質(zhì)等，主要是來(lái)源于兩方面的作用因素：
①“金花菌”生長(zhǎng)中產(chǎn)生的各種代謝酶類對(duì)原料中原有內(nèi)含物 ( 纖維素、果膠質(zhì)、淀粉、蛋白質(zhì)、脂肪、多酚類等 ) 的降解、轉(zhuǎn)化、聚合等作用而形成新型物質(zhì);
②“金花”菌在其生長(zhǎng)過(guò)程中新生代謝產(chǎn)物 ( 尤其次生代謝物 ) 的合成積累釋放，從而明顯改善和提升了普洱茶的品質(zhì)。目前，我們根據(jù)“金花菌”生長(zhǎng)條件和規(guī)律、營(yíng)養(yǎng)需求等方面研究結(jié)果和結(jié)論，形成人工控制下的發(fā)花技術(shù)應(yīng)用于大葉種曬青“金花”緊壓茶的生產(chǎn)，從而進(jìn)一步提升了茶品的品質(zhì)——口感甜、潤(rùn)感明顯，菌香濃郁，原有苦澀感明顯減弱。
我們的研究進(jìn)展
以云南茶葉資源和“金花”菌的利用及深加工，圍繞新型產(chǎn)品開(kāi)發(fā)為目的，得到了云南大學(xué)“雙一流”項(xiàng)目的大力支持，做了一些基礎(chǔ)性和茶葉產(chǎn)品開(kāi)發(fā)研究的工作。
1、設(shè)計(jì)全新分離純化培養(yǎng)用培養(yǎng)基(固體平板培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基)以及培養(yǎng)條件，得到多株在普洱茶和分離平板上均可以產(chǎn)生“金花”——真菌有性繁殖結(jié)構(gòu)子囊果閉囊殼(圖 1)，但在平板菌落形態(tài)上存在較大的差異(圖 2)。
通過(guò)相關(guān)樣品分離純化后根據(jù)菌落形態(tài)篩選出 4 株產(chǎn)“金花”的菌株作為重點(diǎn)研究對(duì)象，通過(guò)分子生物學(xué)測(cè)序(ITS、18S rDNA)鑒定，均為散囊菌屬的不同種(其無(wú)性系顯示為曲霉菌屬、青霉屬)，反映了普洱茶來(lái)源菌株的多樣性：
1 號(hào)菌為雞油曲霉(Aspergillus cibarius)。
2 號(hào)菌為赤散囊菌(Eurotium rubrum)。
3 號(hào)菌為蠟葉散囊菌(Eurotium herbariorum)。
4 號(hào)菌為冠突散囊菌 (Eurotium cristatum )。
針對(duì)以上 4 株菌進(jìn)一步進(jìn)行了察氏培養(yǎng)基菌落形態(tài)分類學(xué)鑒定(見(jiàn)圖 5，4 號(hào)菌)、掃描電子顯微鏡形態(tài)觀察(見(jiàn)圖 6，4 號(hào)菌)等研究，同時(shí)結(jié)合前期分子生物學(xué)鑒定的結(jié)果，4 號(hào)菌最終鑒定為：冠突散囊菌 (Eurotium cristatum )。
根據(jù)分類鑒定的結(jié)果，結(jié)合實(shí)驗(yàn)室小試“發(fā)花”試驗(yàn)及品審結(jié)果，篩選了生長(zhǎng)快、“金花”發(fā)育好、對(duì)“發(fā)花”后茶葉品質(zhì)提升明顯的 4 號(hào)菌株用于生產(chǎn)菌株，對(duì)其發(fā)花工藝技術(shù)進(jìn)行詳細(xì)的研究。
其發(fā)花工藝大體為以云南大葉種曬青茶為為原料，經(jīng)過(guò)菌劑培養(yǎng)、蒸壓、發(fā)花、干燥等工藝得到的“金花緊壓茶”科研產(chǎn)品，送云南省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)所檢測(cè)(以普洱生茶、伏磚茶標(biāo)準(zhǔn)為參考，能檢盡檢)，結(jié)果顯示：產(chǎn)品各項(xiàng)指標(biāo)符合茶葉相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，未有不合格項(xiàng)，其中：冠突散囊菌數(shù)量為 9.7×10 CFU/g(> 20×10 CFU/g，伏磚茶標(biāo)準(zhǔn));真菌毒素(8 個(gè))未檢出。
感官審評(píng)結(jié)論為：該科研產(chǎn)品工藝上引入了發(fā)花工藝，感官品質(zhì)具有普洱茶(生茶)特性的同時(shí)，菌香明顯、滋味醇厚鮮甜，干評(píng)金花豐富，產(chǎn)品具有一定創(chuàng)新性。
近年來(lái)有學(xué)者，針對(duì)黑茶中產(chǎn)“金花”的微生物進(jìn)行了研究，反映出不同茯磚茶企業(yè)成品樣品經(jīng)分離、純化、鑒定存在發(fā)花形成“金花”菌種的多樣性，以冠突散囊菌(Eurotium cristatum ) 為主，同時(shí)還存在謝瓦散囊菌 (Eurotiumchevalieri )、肋狀散囊菌 (Eurotium costiforme )、蠟葉散囊菌 (Eurotium herbariorum ) 和阿姆斯特丹散囊菌(Eurotium amstelodami) 等菌株。
我們對(duì)普洱茶中產(chǎn)“ 金花 ”微生物研究反映了“ 金花”微生物雖說(shuō)不是普洱茶發(fā)酵中的優(yōu)勢(shì)菌，但也非難覓其蹤，普遍存在一些特定環(huán)境和加工成形的茶品中，針對(duì)分離純化的部分菌株進(jìn)行鑒定的結(jié)果顯示分屬不同的種，也呈現(xiàn)出種的多樣性。
同時(shí)，培養(yǎng)物的菌落形態(tài)特征表現(xiàn)不同;培養(yǎng)營(yíng)養(yǎng)要求有較大差異;應(yīng)用發(fā)花后的茶葉品質(zhì)存在較大不同，有部分還帶來(lái)了負(fù)面的結(jié)果。
茶葉與冠突散囊菌共效
茶葉作為我國(guó)有悠久歷史傳統(tǒng)飲品，世界三大飲品之一，其味微苦、甘，性涼，內(nèi)含物有諸多功效，如抗氧化、提神醒腦、清熱解毒、利尿消腫、抗炎殺菌、止咳生津等。
圖 6 4 號(hào)菌電鏡觀察結(jié)果
上左：顯示完整子囊果閉囊殼(含菌絲);上右：人為破壁子囊果及子囊孢子;下：子囊孢子(具冠突結(jié)構(gòu))圖 7 4 號(hào)菌“發(fā)花”產(chǎn)品的內(nèi)部“金花”生長(zhǎng)情況
(顯示“金花”生長(zhǎng)茂盛)冠突散囊菌作為一種益生菌參與茶葉發(fā)酵中，其在茶葉上生長(zhǎng)繁殖代謝過(guò)程中，利用茶葉中的營(yíng)養(yǎng)物可以產(chǎn)生多種初、次生代謝活性產(chǎn)物，同時(shí)，抑制有害菌的生長(zhǎng)，對(duì)茶葉中內(nèi)含物進(jìn)行了再加工轉(zhuǎn)化，使之發(fā)酵過(guò)茶品功效得到了提升和擴(kuò)展，可以達(dá)到食療兼收的目的。
總之，茶葉與冠突散囊菌共效主要包括改善茶葉品質(zhì)、抗氧化、抵制有害菌(細(xì)菌、病毒等)、提高人體免疫、預(yù)防腫瘤、提高酶的活性、以及調(diào)節(jié)維持腸道微生物菌群平衡等。
“金花”茶生產(chǎn)過(guò)程中
會(huì)碰到的問(wèn)題
1、產(chǎn)“ 金花 ”茶品中相關(guān)菌種的多樣性，從而伏茶、六堡茶、普洱茶等自然發(fā)花生成“ 金花 ”不一定都是冠突散囊菌，還有其它相關(guān)菌種參與生成;冠突散囊菌的不同菌株的發(fā)酵能力也不盡相同，這兩方面的原因給生產(chǎn)帶了諸多不確定因素——品質(zhì)是否得到提升，安全性、穩(wěn)定性如何等。
2、基于上述發(fā)花菌種存在的問(wèn)題，需要積極開(kāi)展人工接種發(fā)酵的研究(酸奶制作就是成功的例子)。首先，性狀優(yōu)良菌種收集、鑒定、發(fā)酵性能、成品品質(zhì)和安全性的測(cè)定就成了當(dāng)務(wù)之急;其次，是人工接種的操作工藝流程和要求，接種后冠突散囊菌在茶葉上的促生長(zhǎng)發(fā)酵(發(fā)花)條件的控制，接種及發(fā)酵過(guò)程中雜菌(黑曲霉等)污染問(wèn)題的解決。
3、結(jié)合已發(fā)現(xiàn)的相應(yīng)生物學(xué)功效 ( 對(duì)人體部分重要指標(biāo)的改善、細(xì)胞損傷的修復(fù)等 )，需要加強(qiáng)基礎(chǔ)性研究，主要從代謝產(chǎn)物的提取和成分分析、生理活性與健康功效對(duì)應(yīng)機(jī)制等方面開(kāi)展探索性研究，拓寬其應(yīng)用領(lǐng)域。
4、通過(guò)菌種篩選、馴化及發(fā)酵條件的控制，降低成品茶中發(fā)酵腥味(粗青味等)和酸味等不良?xì)馕逗妥涛哆^(guò)重的問(wèn)題。提升產(chǎn)品滋味的醇和度和爽口性，使之形成甜潤(rùn)滑生津回甘，并具特殊菌香的優(yōu)良產(chǎn)品。
原文節(jié)選自《普洱》雜志
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